SC∕T 7227-2017 传染性造血器官坏死病毒转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法(水产)
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ID： |
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文件大小(MB)： |
0.55 |
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10 |
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日期： |
2021-12-29 |
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ICS 65.020.30,B 41 ←:才叫,中华人民共和国水产行业标准,SC/T 7227一2017,传染性造血器官坏死病毒逆转录环介导等,温扩增(RT-LAMP) 检测方法,Detection method of reverse transcriptation loop-mediated isothermal amplification,{RT-LAMP)for infectious haematopoietic necrosis virus,2017 -12-22 发布2018 - 06-01 实施,中华人民共和国农业部发布,SC/T 7227-20 17,目。昌,本标准按照GBj T 1. 1-2009 给出的规则起草,请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任,本标准由农业部渔业渔政管理局提出,本标准由全国水产标准化技术委员会CSACj TC 156) 归口,本标准起草单位:全国水产技术推广总站、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检,疫科学研究院,本标准主要起草人: 贾鹏、郑晓聪、余卫忠、王津津、李清、刘莹、温智清、何俊强、于力、兰文升、史秀,杰、刘查、秦智锋,I,SC/T 7227-2017,传染性造血器官坏死病毒逆转录环介导等,温扩增(RT - LAMP) 检测方法,坏施d,官措,器染,血污,造防,性和,染定,传判传,了果于,定结用,规仨适,准明准,围柑但柑,范主,备,3 缩略语,下列缩,AMV,Bst 酶:,DEPC:,dNTPs : 脱,EDTA,IH NV: 传,PBS: 磷酸盐缓,RT - LAMP : 逆转,tion),RNA: 核糖核酸Cri,导等温扩增检测方法的试剂和材料、器材和设,2,下列文件对于本,件。凡是不注日期,GB/ T 6682,GB/ T 1,GB 19489,GB/ T 27,SC/ T 71,OIE ((,tase),4 概述,在I旧HN飞V 基肉组5 401 bp~ 5 701 bp 区域设计6 条特异引物(参见附录A)λ，在Bs必t 酶的作用下,6臼5 0C恒温扩增3ωOm口mi口10γ~γ‘、‘、‘,变化判定结果,5 试剂和材料,5. 1 水: 符合GB/ T 6682 中一级水的规格,5.2 I HNV 参考株:由农业部指定单位提供,1,SCjT 7227-2017,5.3 75 % 乙醇: 用新开启的元水乙醇(分析纯)和DEPC 水(见附录B 中的B. l)配制，一20 0C 预冷,5. 4 Trizol 试剂， 4 0C 保存,5. 5 异丙醇: 分析纯试剂，使用前预冷至一20 0C ,5. 6 ?氯甲皖:分析纯试剂，常温保存,5.7 dNTPs: 含dCTP 、dGTP 、dATP 、dTTP ,5.8 Bst 酶: 一20 0C 保存，酶浓度为8 Uj μL ，避免反复冻融,5. 9 甜菜碱: 浓度为5 mo l/L，一20 0C 保存，避免反复冻融，见B.2 o,5. 10 10X ThermoPo l 缓冲液:含0 . 2 mol/ L Tris - HC1, 0. 1 mol/ L KCl , 0.1 mol j LCNH4 )ZS04',20 mmol/ L MgS04 和0.1 % Triton X - 100 ，一20 0C保存,5. 11 硫酸镜CMgS04 ) : 浓度为150 mmo l/ L ,5. 12 AMV 逆转录酶: 一20 0C保存，避免反复冻融或温度剧烈变化,5. 13 磷酸盐缓冲液(PBS) : 浓度0 . 01 mol/ L,pH 7 . 2 ，常温保存(见B.3) ,5. 14 显色液: SYBR Green 1 (见B. 4) 或其他等效的显色试剂,5. 15 LAMP 引物: - 20 0C 保存备用。其序列如下:,正向外引物(F3) : 5'- GCAATTCTCCTCCAGAGC - 3';,反向外引物CB3) : 5'- TGTCGGTCACTCTGAGG - 3';,正向内引物CF1c十四):5 仁τ'CfCCTG腎口τ'GGTG岛也丁α了rc才TCTTCAGAL气GAGTTCGTGGA - 3' ;,反向内引物CB1c+B2) :5'- GTGTAACACCGTATGCGGACTTATGACTGCCATCAACACG - 3';,正向环引物(LoopF) : 5'- ATCCTCGATCTGTGAAGTACAAG- 3';,反向环引物(LoopB) :5'- CCTTGCCTGGATCAAGATCA - 3' 0,5. 16 矿物油:无RNA 酶和DNA 酶,5. 17 阳性对照: I HNV 细胞培养物、组织、含有曰的片段的核酸,5. 18 阴性对照:经过GBj T 15805 . 2 验证的不含I HNV 的组织或细胞培养物,5. 19 空白对照: DEPC 水,6 器材和设备,6. 1 分析电子天平,6. 2 冷冻高速离心机,6. 3 恒温金属浴或恒温水浴锅,6. 4 微量移液器: 茧程包括O. 5μL~l川OμL;l刊OμL~ 10∞OμL;100μμL~户~、-、白‘、‘,6.5 无菌研钵或研磨棒,6.6 - 20 0C 普通冰箱,6. 7 元菌剪刀、慑子、1. 5 mL 离心管、PCR 管、与微草移液器相匹配的枪头,6. 8 计时器,6.9 pH 计,7 操作步骤,7. 1 采样,7. 1. 1 采样对象,IHNV 易感鱼类(参见附录C) ,2,SC/T 7227-2017,7. 1. 2 采样数量,采……
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